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时间:2020-10-22 20:39  编辑:wendj

论文作者签名:,萋二蟹

指导教师签名:

论文评阅人1:

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评阅人4.

评阅人5:

答辩委员会主席:. 工查出 熬援—— 委员1:陈建真数援

委员2:谢堙教援

委员3:王丞岩副硒宜员

委员4.—— 焦抱垡 副婴塞员 委员5:

答辩日期:2011.05.29

I㈣\卿 Y1910047杭州师范大学研究生学位论文独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得揎型里至整盘鲎或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作王明确的迸胡并表示谢意..一

学位论文作者签名:孟飞 签字日期:v叫1年r月弓。日 学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解垫必塑垫盘堂有权保留并向国家有关部门 或机构送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权垫幽!重 整盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

(保密的学位论文在解密后适用本授权书)

学位论文作者签名:孟7酶

学位论文作者签名:盘8导师

签字日期:洳1年r月弓o.日 签字日期-哆。f.f年厂印

杭州师范大学硕士学位论文 致谢 致谢

本论文是在导师谢恬教授的悉心指导下完成的。三年的硕士学习生活即将结 束,能有幸得到恩师的教诲,是学生受用不尽的宝贵财富,在此,谨向谢恬教授 表示衷心的感谢!此外,俞春娜博士在过去三年中给予了我无微不至的指导和帮 助,使我能够顺利完成硕士论文,祝俞老师今后工作顺利、生活幸福。

本论文的完成亦得感谢李海峰博士、张顺成同学和朱建华师弟等的大力帮 助。李博在蛋白纯化和酶催化方面给予了我很多指导;张顺成同学在酶活检测和 蛋白电泳实验中提供了大量的帮助及便利;和朱建华师弟相处的时间不长,但他 的认真以及安静给我留下了很深刻的印象,其实这才是实验室中需要的人才。 感谢杨兵和杜鹏飞两位师兄,很高兴能在杭州见到两位安大学长,在我刚进 入实验室阶段,是他们耐心地教会了我基本的实验操作及仪器使用。

感谢生物医药与健康研究中心的所有老师,和在此工作的实验人员。

感谢熊小龙、金鹏、张方凯、陈飞飞、周秀玲、高允允、王秋艳、赵金刚、 袁通、陈森林、周硕、翟晓红和肖仁钟等等师弟师妹,在此不能一一将你们的名 字写下,平时的实验中也没少麻烦你们,希望你们在接下来的时间里能取得很好 的成绩,收获自己想要的结果。

感谢韩来红、陈亮文、温汉华、叶听、潘园园、韩风、张顺成和吕丹青等同 学,两年的日子里,大家一起经历了许多风风雨雨。学习之余能和韩来红谈论 NBA和欧洲足球联赛,每天晚上能和陈亮文一起跑步,也从温汉华身上学到了 很多学校里和书本上学不到的知识。

感谢生命与环境科学学院的周振华、王震、张大卫、胡旭、孟莎莎、赵红燕、 朱江敏、朱胜男、沈少华、徐京、杨杨、张华美、刘慧娟、黎乾和郭丹等等同学, 研一时的集体活动以及后来的多次聚会让平凡的学习生活充满了色彩。

“感谢向太和、王慧中两位老师,以及樊叶杨、庄杰云老师,还有鲍钱江师兄, 你们在我的研究生初期给予了我很大的帮助和指导,在此表示衷心的感谢。

孟飞

2011年3月于杭州仓前

杭州师范大学硕士学位论文 摘要 摘要

倍半萜烯类化合物(sesquite叩ene)及其衍生物广泛分布于自然界中,是植 物精油的重要组分之一,很多倍半萜化合物具有明显的生物活性和应用价值。圆 柚酮((+).nootkatone),属于倍半萜化合物瓦伦西亚烯的酮类衍生物,具有独特 的芳香气味,作为重要的香料原料在食品、日用品、化妆品以及烟草等等行业中 有着广泛的应用,具有很高的市场价值。

圆柚酮在天然精柚中的含量很低,再加上其立体异构体以及众多萜烯类化合 物的存在,一般很难直接分离获得,圆柚酮的天然提取路线不具有商业价值。目 前,工业上常通过化学氧化价格相对便宜的瓦伦西亚烯((+).valencene)来获得 圆柚酮,但在这过程中往往使用一些具毒性或污染性的氧化剂,对环境造成严重 的危害。近十几年来,采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为这一领域 研究的新方向,特别是利用细胞色素P450BM-3(c”ochrome P450BM.3,CYP450BM.3) 对瓦伦西亚烯进行氧化,已成为获得圆柚酮的一条潜在途径。

来源于巨大芽孢杆菌(B口cf跏肌昭口fP一”m)的CYP450BM.3是CYP450家族当 中特殊的一员,因其亚铁血红素结构域和负责电子转移的FAD/FMN还原结构域 都包含在同一条肽链中,因此该酶在进行催化时无需CYP450还原酶的辅助作用, 这个独特的性质使它具备了开发成为工业用P450酶的潜力。以定点突变、易错 PCR和体外同源重组技术(DNA shummg)等等为代表的定向进化技术已被用 于对CYP450BM-3进行改造,以期获得对非天然底物具有良好催化活性的突变体。 本文基于已有文献报道,旨在寻找对瓦伦西亚烯具有更高催化效率和产物选择性 的CYP450BM.3突变体。

本研究利用定点突变技术,对野生型CYP450BM.3基因进行改造,获得了

R47L/Y5l F/F87A和A74G/F87V/L188Q两个突变体。将野生型和突变体基因分别 ・O 连接入pET28a(+)中进行重组表达,利用纯化的重组酶在体外对底物瓦伦西亚烯

进行催化。气相色谱被用来检测各酶的催化产物,并分析、比较各突变酶与野生 型CYP450BM.3对瓦伦西亚烯的催化活性。

在体外,野生型CYP450BM.3-底物复合物对NADPH的催化速率为31士1.O nmol (nmol P450)-1“r1,但产物中没有检测到圆柚酮生成:突变体R47LⅣ5lF/F87A

杭州师范大学硕士学位论文 摘要

对应的这一氧化速率要高于前者,为79士6.5mol(nmol P450)-1m打1,并在其催化 产物中检测到圆柚酮的生成,但圆柚酮含量仅占总产物的6.8%;与此同时,A74G/ F87v/L188Q表现出与后者相当的催化效率(77士7.2nmol(nmol P450)-1min叫), 但产物中圆柚酮的含量更高,达8.O%。

A74G/F87v/Ll 88Q是本课题成功获得的一个新的可以催化瓦伦西亚烯生成 圆柚酮的CYP450BM.3突变体,表现出迄今为止最好的产物选择性,同时兼具有较 高的催化效率,但还未达到工业用酶的要求。在接下来的研究中,我们会设计和 试验更多的突变体,以便能取得更大的进步。

关键词:圆柚酮;瓦伦西亚烯;生物催化;倍半萜烯类化合物;细胞色素P450BM-3Ⅲ

Abstract

Sesquiterpene and its deriVatiVes are widely distributed in nature and are important.components of plant essential oils,most of which have good bi0109ical actiVities. (+)・Nootkatone, sesquiterpene (+)一Valencene’s ketone derivative, has

aromatic smen and is used aS naVors

or仔agrances:iIl food,daily necessities,

cosmetics and tobaccos etc.It has a wide

range of applications with high market value. The content of(+)-nootkatone in nature is very low,so it is di所cult to obtain (+)。nootkatone丘om direct s印aration.Cullrently,a common altemative method iIl 协dustry is direct oxidation of(+)-Valencene,which is relatively cheap.However'

some non。enVironmental 衔endly oxidants aure used iIl the

process of chemical

catalysis, causiIlg serious ha姗 to the eflViroIullent. In

recent decades,

biotransforn豫tion of(+)-Valencene to(+)-nootkatone has become a new direction in thiS field,especially the use of c”ocllrome P450BM.3(CYP450BM.3)in the oxidation reaction.

CYP450BM.3丘om曰口ci盯淞朋Pg口fP一“聊is unique among the CYP450f.amiIy,in

which heme domain and FAD/FMN reduction domaill

responsible for electron trans佬r are mcluded ill the same peptide chaill.ThiS featllre makes“1汰ely to be util也ed iIl mdustry.CurrentlX directed eVolution has been used to alter CYP450BM.3m

0rder to obtaill some mutants that have

good non-natural substrate catal”ic activit y. Based on preVious r印orts,this work a沛ed to f.md new CYP450BM.3mutants which

haVe higher catal”ic emciency and product

selectivity toward(+).valencene.

In this study; site—directed mutagenesis was

employed to obtain the Inutant

R47LⅣ51F/F87A and A74G/F87V/L188Q of Cy尸钉p附,.T11en the mutated genes

were ligat色d with pET28a(+) Vector for heterologous expression respectively. Immobilized metal a币nity chromatography was used for the puri6cation of target proteins and the oxidation actiVities toward(+)一valencene were detelmined. Gas cllromato伊aphy was used to detect catal”ic products and the catalytic activities

between mutants and the wild type CYP450BM.3were

analyzed.

The oxidation rate of NADPH catalyzed by w订d-type CYP450BM.3.substrate Ⅳ

coHlplex was 3l士1.0nⅡ101(nmol P450)~min。】协订f,诊,but(+)一nootkatone

was not detected among the products.For the mutant R47I../Y5l F/F87A,the oxidation rate of

NADPH was 79土6.5啪ol(nmol P450)一mill~,and(+).nootkatone was detected among the products with a ratio of

6.8%. ne oxidation rate of the 舢tant A74G/F87V/L l 88Q was 77土7.2mnol(nmol P450)d min~,equiValent to the

mutant R47I。,Y5l F/F87A.The ratio of(+).nootkatone in the products catalyzed by the mutant A74G/F87V/Ll 88Q was 8.0%,showing better product selectiVity than the mutant R47UY51F/F87A.

A74G/F87V/L188Q was found to transf0珊(+)-Valencene to(+)一nootkatone with high catalytic e硒ciency and the best product selectiVity by far ill this study. HoweV%this mutant has not yet met the requirements of iIldust^al ellzymes.In 如rther snl电we will design and test more CYP450BM.3mutallts iIl orderto achieVe 星,eater pr0伊ess.

Kby Wbrds:(+)-n00tkatone;(+)-Valencene;biocatalysis;sesqu“e叩ene;c”ocllrome P450BM-3

V

杭州师范大学硕士学位论文 目次 目 次

致谢………………………………………………………………………………………………………..I 摘要……………………………………………………………………………..II Abstract…………………………………………………………………………………………………….1V 目 次……………………………………………………………………………………………………..VI l绪论……………………………………………………………………………………………………….1 1.1天然香料圆柚酮…………………………………………………………一1 1.1.1圆柚酮概述…………………………………………………………1 1.1.2圆柚酮的应用………………………………………………………2 1.1.3倍半萜及其天然合成途径…………………………………………2 1.1.4圆柚酮的化学合成研究……………………………………………4 1.1.5生物技术合成圆柚酮………………………………………………6 1.2定向进化………………………………………………………………….7 1.2.1定向进化的概念及策略…………………………………………….7 1.2.2定点突变……………………………………………………………8 1.3细胞色素P450BM.3………………………………………………………一9 1.3.1细胞色素P450概述………………………………………………一9 1.3.2细胞色素P450BM.3的结构与性质………………………………….10 1.3.3细胞色素P450BM.3的定向进化研究……………………………….12

1.4课题目标及主要研究内容………………………………………………..14

2重组表达质粒的构建…………………………………………………………..16 2.1引言………………………………………………………………………..16 2.2材料与方法………………………………………………………………17 2.2.1菌种与质粒…………………………………………………………17 2.2.2试剂与器材………………………………………………………..18 2.2.3实验方法…………………………………………………………..19 2.3结果与分析……………………………………………………………….24 2.3.1目的基因两端添加酶切序列………………………………………24 2.3.2目的基因连接入pMDl9.T载体…………………………………..25 2.3.3pET28a.CYP450BM-3重组表达质粒的构建…………………………27 2.3.4pET28a-R47坍51F/F87A重组表达质粒的构建………………….28 2.3.5pET28a-A74G/F87V/Ll 88Q重组表达质粒的构建………………..29 2.4小结………………………………………………………………………………………………30

杭州师范大学硕士学位论文 目次 3蛋白突变体的诱导表达与纯化…………………………………………………3l 3.1引言………………………………………………………………………………………………3l 3.2材料与方法………………………………………………………………33 3.2.1试剂与器材…………………………………点…………………..33 3.2.2实验方法……………………………………………………………34 3.3结果与分析………………………………………………………………36 3.3.1蛋白诱导表达条件的优化…………………………………………36 3.3.2CYP450BM-3和R47W51F/F87A的固相金属亲和纯化…………..37 3.3.3A74G/F87V/L188Q的固相金属亲和纯化…………………………39 3.3.4蛋白表达量分析……………………………………………………40

3.4小结………………………………………………………………………………………………41

4酶促反应的建立与气相分析……………………………………………………43 4.1引言………………………………………………………………………………………………43 4.2材料与方法………………………………………………………………44 4.2.1试剂与仪器………………………………………………………一44 4.2.2实验方法…………………………………………………………..45 4.3结果与分析………………………………………………………………46 4.3.1酶底物复合物催化NADPH氧化速率的比较…………………….46 4.3.2样品标准气相图谱的建立…………………………………………49 4.3.3内标法气相分析曲线………………………………………………5l 4.3.4野生型CYP450BM.3催化产物气相分析…………………………..52 4.3.5突变酶催化产物气相分析…………………………………………53

4.4小结………………………………………………………………………………………………54

5结论与展望………………………………………………………………………56 5.1结论………………………………………………………………………………………………56 5.2论文的创新及意义……………………………………………………….57 5.3展望………………………………………………………………………57参考文献………………………………………………………………………….59附录实验室常用试剂、缓冲液的配方………………………………………….69作者简历及在学期间所发表论文…………………………………………………73

VⅡ

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 1绪论

1.1天然香料圆柚酮

1.1.1圆柚酮概述

圆柚酮((+)一n00tkatone),别名诺卡酮,(4尺,4舔,6R)一4,4口,5,6,7,8一六氢-4, 4口.二甲基.6.(1.甲基乙烯基)萘烯.2(3奶.酮,分子式为C15H220,相对分子质量为 218.34(图1.1),是倍半萜烯类化合物(sesquiteFcne)瓦伦西亚烯((+).valencene) 的酮类衍生物,属于雅槛蓝烷(eremophilane)系的双环倍半萜酮(陈永宽等,2004)。 无色针状晶体或淡黄色油状液体,纯品熔点为35.36℃,沸点125℃,不溶于水, 溶于乙醇及其他一些有机溶剂,具有持久而强的柑橘样香味,在低浓度时表现出 明显的柚子香气,并带有甜橙、木香香韵,但味苦。

图1.1圆柚酮的分子结构(左)和晶体结构(右)(引自陈永宽等,2004)

Fig.1.1Molecular structure(1e助and crystal s咖cture(right)of(+)-nootl(atone(劬m Chen

Y锄争K啪ef Df.,2006)

圆柚酮是20世纪60年代发现于阿拉斯加黄柏(Chamaecyparis n00tkatensis)的 木质成分以及枘子皮油的挥发性组分中(Erdtm锄甜口,.,1962;Be丌y硝口,.,1967), 随后,在香根草油(Andersen,1970)以及葡萄的香气成分中都发现了该化合物 (Sawamura鲥口f.,1988)。天然圆柚酮主要存在于香柠檬油、圆柚油、柠檬油、 柑橘油、白柠檬油和红橘油等挥发油中(杨晓红等,2001;周永红等,2004), 由具有相似立体结构骨架的瓦伦西亚烯(紫外最大吸收波长为236nm)氧化而产 生(Berry引口,.,1967)。尽管容易自然氧化,但是瓦伦西亚烯本身也可以作为复 丫‰

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合调味料和香料使用。

1.1.2圆柚酮的应用

香精工业是加香产品配套的重要原料工业,涉及包括饮料、食品、酒类、洗 涤用品、卷烟、化妆品、医药、牙膏、饲料、皮革及纺织等工业领域,数据显示, 香精香料的世界需求量近年来以每年4.7%的速度增长,其销售额在世界精细化工 大行业中仅次于医药行业,居第二位。而香料是调配香精的原料,圆柚酮作为香 料物质可用于调配食用香精(Muller Pf口Z.,1998)和烟用香精等等,因此具有很 高的市场价值。特别是在烟草行业中,圆柚酮作为香味剂加在卷烟中,具有增加 卷烟香气、丰满其香味和降低烟气的刺激性等作用(陈永宽等,2004;谢功昀, 2008)。圆柚酮拥有多种立体异构体(Ohlo噩1971),分子空间构象上的微小差 别变化就将导致香气特征的变化(陈永宽等,2002),研究表明,将圆柚酮与其 立体异构体共同作用可能会形成更好的香味效果(Muller Pf口,.,1998;Xie Pf以, 2009)。

圆柚酮的应用不仅限于其作为调味化合物的使用,关于圆柚酮的药理功效已 有诸多研究报道(Tassaneeyal(ul甜口,.,2000),如圆柚酮可以抑制乙酰胆碱酯酶 活性(Miyazawa甜口,.,1997,2001),在某些生理条件下可激活细胞内的蛋白激酶 (Murase纠口,.,2007)等等。另一个潜在的应用领域是作为杀虫剂使用(McAllister 甜口,.,2010),研究表明,分离自益智中的圆柚酮对果蝇幼虫具有很好的杀伤活性 (Miyazawa“口,.,2000),同样的毒性作用还表现在对台湾乳白蚁(Zhu甜口,., 2003;Zhu甜口,.,20lO)、蜱和跳蚤(Panella甜口,.,2005)的试验中。

1.1.3倍半萜及其天然合成途径

萜类化合物(te叩e110id)是一大类结构多变、骨架庞杂、种类繁多且具有广泛 生物活性的天然物质,其化学结构可以看成是异戊二烯的聚合体及其各种含氧衍 生物(付佳等,2003;杨少青等,2010)。萜类化合物主要分布于植物体中,但 在动物和微生物体中也发现了大量萜类化合物的存在(Rohdich甜口,.,2001),近 年来在海洋中也发现了众多的萜类化合物(周雪松等,2005;付青姐等,2009)。

2

根据萜类化合物含有的异戊二烯单体数目可将其分为半萜(hemite印ene)、单 萜(monote巾ene)、倍半萜、二萜(diterene)、三萜(triterene)、四萜(tetate印ene)以 及多萜(pol”e叩ene)等。其中,单萜和倍半萜及其含氧衍生物是植物挥发油的重 要组成成分,二萜类以上的又统称为高萜类化合物,是形成树脂的主要组分,一 般不具有挥发性(汪洋等,2003:徐仁生等,2004)。二萜类化合物包括赤霉素 (植物激素),而三萜角鲨烯是所有固醇类的前体。

约有7000多种的倍半萜是萜类化合物中最大的一类,并且是植物香精油的 共同成分(杨涛等,2005)。许多倍半萜及其酮类、醛类和酮类衍生物共同组成 了植物挥发油中的高沸点部分,一些倍半萜类化合物具有生物活性或是生物代谢 的前体,而另一些则具有香味、药效的性质,并可用作调味品(Fraga,2004)。如 以倍半萜5一印f.aristolochene为前体合成的植保素甜椒醇(Ralston甜口,.,2001)、可 作为强抗疟复方青蒿素前体的紫穗槐-4,11.二烯(Ⅺayman,1985;Chang鲥口Z., 2000;Gao甜以,2001)(图1.2)以及发现于甜橙油中的瓦伦西亚烯(图1.2)等 等,后者的酮衍生物、发现于柚子汁中的诺卡酮,已成为香料化合物生产的一个 目标。

所有天然萜类的前体都是异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP) (Radykewicz Pf口Z.,2000)。在植物体内,存在两个独立的IPP合成途径:MVA 途径(meValomte pathway)(图1.2)和MEP途径(non—mevalonate pathway)(图 1.3)(Femandes“口,.,2010)。前者从乙酸开始,在乙酰辅酶A的作用下,经由 3.羟基.3.甲基辅酶A最后转变为甲羟戊酸(L)rnen,1967),这种途径存在于细胞质 中,故又名细胞质途径(cytosolic pathway),主要负责倍半萜、三萜和多萜等物 质的生成;后者位于高等植物的质体中,如有色体和叶绿体等等,又被称为质体 途径(plastidic patllway),主要负责半萜、单萜、双萜、四萜和多萜等物质的生 成(Eisenreich ef口,.,1998;Chappell Pf n,.,2004)。因此,生物合成圆柚酮的前体 ——瓦伦西亚烯,是由MVA途径产生的(Ziegler甜以,1977)。但是,目前仍不 清楚,为什么瓦伦西亚烯在橙子的成熟过程中持续积累,但在柚子中却会被进一 步氧化为圆柚酮。也许圆柚酮可以起到防御的作用,或者,可以吸引动物来吃这 些果实(Sharon鲥口,.,2003)。

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图1.2萜类物质生成的MvA途径(引自杨少青等,2010)

Fig.1.2MVApathway 0fte叩∞oids(厅om Yang Sllao.Qillg日口,.,2010)

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图1.3萜类物质生成的MEP途径(引自杨少青等,20lO)

Fig.1.3MEP pathway ofterpenoids(丘伽Yang Shao-Qing P‘∥,.,2010)

1.1.4圆柚酮的化学合成研究

圆柚酮因具有宜人的柑橘香气而引起了人们的普遍关注,自其被发现以来, 关于圆柚酮的天然分布、晶体结构及其多种立体异构体的香味特征,都得到了广 4

产 Ⅸ嘞 啪 鼯一

华 懈 羔藩 。公 .8凡

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 泛的研究(王帅斌,2009)。传统上圆柚酮是从柚子油中提取的,它的价格和产 量取决于每年柚子的生长情况,而柚子树只能种植在少数条件适宜的地区,并且 易受环境条件的影响。谢建春等(2006)发现,通过蒸馏萃取和延长蒸馏时间有 利于所得柚皮油中圆柚酮含量的提高。

由于圆柚酮的自然含量非常少,当前,食品、化妆品和制药行业所需求的圆 柚酮主要通过化学合成来得到满足。Hunter等(1965a)采用铬酸叔丁酯(具有 致癌性)来催化倍半萜烯类化合物瓦伦西亚烯生成圆柚酮(图1.4),氧化剂重铬 酸钠也可用于上述反应。Pesaro等(1968)报道了以4.acetyl-1.ethoxycylohexee 为原料从头合成圆柚酮的研究,类似的合成原料还包括环己烷衍生物(Dastur, 1973)、二甲基1,.ketopimelatc、诺蒎酮、4B,4aB.dimethyl.△6,‘一octalin.1.one

甜lylene—acetal、5一methyl一3-ethoXy一2-cyclohexenone(Majetich以口f-,1985)和p蒎烯 等等。以一价铜盐(Ohlo风1971)和大量玫瑰红作为催化剂对瓦伦西亚烯进行 立体选择性光氧化的研究也有报道。过乙酸叔丁酯和叔丁基过氧化氢与表面功能 化的硅胶负载型金属催化剂(Co(II),Cu(II)和Mn(II))联合作用,可以 氧化瓦伦西亚烯的烯丙基碳,生成圆柚酮。Behnl(e等(1985)曾报道采用Sab啪i 反应合成得到圆柚酮。

Ho

图1.4瓦伦西亚烯氧化为圆柚酮(引自H曲t盯甜口,.,1965a)

Fig.1.4Oxidation厅om(+)-Valencene to(+)-n00tl(atone(劬m Hunter“口,.,l 965a)

综上所述,在圆柚酮的化学合成反应中大量使用了重金属催化剂,如三氧化 铬、铬酸叔丁酯和重铬酸钠等等,无疑对环境有着严重的危害性。与重金属催化 剂不同的是,过乙酸叔丁酯和叔丁基过氧化氢等化学催化剂虽对环境没有危害, 但在实际的工业生产中仍需要有严密的安全防范措施,因为它们是强氧化剂,可 能会引起火灾,另外,叔丁基过氧化氢还是一种具强腐蚀性的化合物。根据欧洲 食品法规,采用任何一种化学方式合成的圆柚酮都不能视其拥有天然香味,这无 疑不利于圆柚酮的销售及应用。此外,圆柚酮多种立体异构体的存在也给其化学

杭州师范大学硕士学位论文 1绪论 合成带来了一定的困难(陈永宽等,2002)。由于这些不利因素,人们不得不探 索新的圆柚酮合成方法。

1.1.5生物技术合成圆柚酮

由于市场的需求以及技术的推动,近几十年来,采用生物技术来研究生产圆 柚酮已成为这一领域发展的新趋势(Hashimoto纠口,.,2003;Fraatz Pf口,.,2009)。 包括植物组织培养、酶的体内和体外催化等等方法都已被用于圆柚酮的合成研究 (Sven订口,..2010)。一个很有吸引力的合成方案是利用生物酶对瓦伦西亚烯的 烯丙基碳(C2)直接进行氧化,这样可以在较温和的条件下快速生产出具有“自 然香味”的圆柚酮(Nesheim d口,.,1996)。其中,瓦伦西亚烯(Hunter甜口,.,1965b) 在通常情况下为无色液体,呈柑橘样香气,可以从柑橘类水果中大量提取,价格 相对便宜。

早在l 982年,Drawen及其同事就尝试通过柑橘组织培养途径来生产圆柚酮, 但只检测到极微少的含量。后来,Rj0等人(1991)在不同的柑橘愈伤组织中都 检测到了瓦伦西亚烯和圆柚酮的积累。对葡萄柚细胞进行培养,6小时后其转化 瓦伦西亚烯生成圆柚酮的浓度可达到1.1mg L-1(Drawen纠口L,1984)。其它具有 类似转化功能的植物细胞还包括七叶胆、锦鸡儿和木芙蓉(Sakamal(i Pf口,.,2005), 其中,对七叶胆细胞进行组织培养,并加入瓦伦西亚烯,20天后检测到圆柚酮的 浓度最高可达600Ing L-1(62m01%)。同年,Furusawa等报道了小球藻属亦可用于 对瓦伦西亚烯的C2进行氧化。但通过植物组织培养的方式来生产圆柚酮也存在一 些不利的因素,包括过程成本太高,而且生长缓慢、圆柚酮产量过低,这些不利 因素限制了它朝向工业化方向发展。

菊苣根中的微粒体酶在NADPH存在的情况下,可氧化瓦伦西亚烯生成圆柚 酮,但现在还无法确定具体是哪种酶发挥的作用(心al(er甜口,.,2003;BouMneester 甜n,.,2007)。脂氧合酶也曾被报道用于类似圆柚酮的合成反应(Muller d口,., 1998)。最近,从甜橙中克隆的瓦伦西亚烯合成酶基因已经在大肠杆菌中进行了 功能性表达(Sharon甜口,.,2003;Chappell甜口,.,2004)。这些研究代表了对植物 中可能氧化瓦伦西亚烯生成圆柚酮酶的探索。

Willershausen和Graf于1996报道了利用白腐菌中的木质素过氧化物酶来催化 6

杭州师范大学硕士学位论文 l结论 瓦伦西亚烯生成圆柚酮的研究,氧化反应还生成了一些醇类的副产物,但没有给 出具体的结构鉴定数据。Huang等(2001)设计了利用真菌漆酶分两步催化瓦伦西 亚烯生成圆柚酮的试验,反应在柠檬酸盐缓冲液(0.1M,pH 3.5)中进行,得到的 圆柚酮产量为27mo眺。对球毛壳菌进行浸没培养,加入瓦伦西亚烯,3天后产 生圆柚酮的浓度为8mg L-1(2m01%)(Kaspera订口,.,2005),CYP450被认为在这其 中发挥了主要作用。Furusawa等研究了利用毛霉菌、葡萄座腔菌和香蕉黑腐病菌 来对瓦伦西亚烯进行生物转化,但最终得到的圆柚酮产量都很低。在过去的40年中,虽然圆柚酮的植物合成途径已普遍被人们所掌握,并且探索出了众多圆柚 酮的生物催化合成方法,但至今仍未建立起一条可行的圆柚酮工业生产路线。基 于CYP450酶类或真菌催化将会为此研究带来新的机遇。

1973年,Dhavlil(ar等首次报道了采用细菌催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮的研 究,两种肠杆菌催化生成圆柚酮的最大产量为11mo眺。利用红球菌进行的类似 合成途径已被申请为专利(Ol(Ilda纠口,.,1994),在50ml摇瓶中,投入500mg瓦伦 西亚烯可生成圆柚酮2.5mg(0.5m01%)。2006年,Chappell等申请了一项柑橘瓦伦 西亚烯合成酶(C“ms valencene synthases,CVS)的专利,包括它在生产圆柚酮 上的应用。

Sowden等(2005)利用CYP450BM-3突变体通过全细胞催化的方式来合成圆柚 酮,其中R47坍5lF/F87A突变体对瓦伦西亚烯具有很高的氧化速率,但产物中

圆柚酮的含量很低。CYP450cam的天然底物是樟脑,由于瓦伦西亚烯分子更大且 疏水性更强,所以野生型CYP450cam对瓦伦西亚烯没有催化活性,但一些 CYP450cam的点突变体可催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮,其中F87vⅣ96F/L244A 催化可使圆柚酮的产量达到9mo眺。

1.2定向进化

1.2.1定向进化的概念及策略

进化一词起源于拉丁文创D胁ffD,原义为“展开”,到了19世纪,“进化”被 引入至生物学中(虞青,2008)。与传统意义上的自然进化相比,人工进化主要 是通过传统育种、诱变育种以及定向进化等技术来进行的。定向进化是指模拟自

7

杭州师范大学硕士学位论文 】绪论 然进化机制,利用基因突变、重组和定向筛选等技术,使生物大分子获得人们所 期望的功能(陶苏丹等,2007)。定向进化技术可以改变酶的催化选择性、增强 或改变酶的催化活力、提高酶分子的稳定性以及对环境的适应能力等等(吴梧桐, 2004)。目前,该技术已逐渐渗透到工业生产以及科学研究的各个领域。

在定向进化操作中,突变文库的构建负责积累目标突变,提高突变的几率; 目标表型的筛选是通过高通量的筛选技术(Hi曲1.Ilrougllout Screenillg,HTS)来 获得有利的突变体(Kuellllero甜n,.,1997)。

定向进化可分为突变组合与非重组的点突变两大类,后者包括:在特定位点 引入随机突变的饱和定点突变(Site.saturation Mutagenesis)、在随机位点引入随 机突变的易错PCR(Error-prone PCR)和定点突变(Site.dhcted Mutagenesis) 等等(Anton百口,.,2002)。重组突变包括:DNA重组(DNA Shum洒g)、随机引 物体外重组(Random-pr硫iIlg加订加reCombillatioIl'RPR)、家族DNA重组(Family Shumillg)、交错延伸(Stagered eXtension proeess,StEP)、非序列同源蛋白重组以 及渐进切割杂和酶技术等等。除此以外,定向进化的策略还有很多。

突变文库的筛选方法可以分为“选择”和“筛选”两大类,前者是通过生物 体产生变异后在特定条件下形成的生存优势来获得目标突变体,后者通过检测目 标产物特定的性质从而筛选出期望的突变体。定向进化的筛选策略包括应用细胞 或噬菌体展示进行高通量筛选、核糖体展示技术(Ribosome Display,Im)、基因 作用机制筛选或体内筛选和体外区室化(伽Vf肋companmentalization,IVC)等等, 其发展趋势是在高通量和高灵敏度的基础上,向自动化和高效率的方向发展。 随着人们对各种酶和其他蛋白质微观结构了解的增多,非理性设计的定向进 化将越来越以有的放矢的定点突变来体现。

1.2.2定点突变

定点突变技术,是指通过聚合酶链式反应(Polymerase Chaill Rea幽oIl,PCR) 对目的DNA片段的碱基序列进行改造,包括碱基的添加、删除和置换等等(图 1.5)。定点突变属于理性设计,对某已知基因的特定碱基进行突变,可以改变对 应氨基酸的序列和蛋白质的空间构象,这有助于人们对蛋白质结构和功能关系的 了解(Sacehettilli甜口,.,1997;Rudi刃口,.,2007)。定点突变技术有着很高的应用价

8

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 值,如研究蛋白质相互作用位点的结构,改造启动子或者DNA作用元件,改变 酶的活性或者动力学特性,提高蛋白质的抗原性、稳定性或活性,研究蛋白质的 晶体结构,以及药物研发和基因治疗等等许多方面(G曲ard Pf口,.,2009)。

各种突变实验引钠 5’\一

盟 lAnchorF.AnchorR.-ntl.m住……)

I:勰引KIn州on) 觚栅R 兰二:竺!』:始掇板 .--_‘I.-.._-JE‘_-_-_.--, .. ■■■■●■■■●■__■■■■●■■■■■●■■●■■o■■■■■●●■■_■■■■●■■■●●■■_●_●■一一■暑__Anchor F l Extensjon.Ljgauon Anchor R :∑三==二 =:兰三:=二 二兰=苎 =. 二==. :! 兰 =二 二』:始攫板

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突变簟链

I PcR -E圳R ● =:===:====鼍=============:::====:=突变DNA片段 ———————————r——————r——————1r_———————o^^…一n M

I酶切。突变DNA片段纯化

■ l赡聃貅

筛选阳性克隆.DNA蠢序

l

图1.5定点突变示意图

Fig 1.5Site—directcd nmtage北sis

1.3细胞色素P450BM-3

1.3.1细胞色素P450概述

细胞色素P450酶(cytocllrome P450,ECl.14.14.1),分子量在46.60l【Da范围 内,其化学本质为含有血红素的单链蛋白质,结构和性质相似但不尽相同,属于 非专一性的氧化代谢酶系(季海涛等,1998;夏伟,2000)。1958年首次发现于 哺乳动物肝微粒体中,命名的由来是由于其与CO结合后在450nm处有明显吸 收峰(Yasutal(e订口,.,2007)。细胞色素P450酶广泛分布于动物、植物和微生物 体内。20世纪40至50年代,药理学、化学、生物化学、癌生物学和内分泌学 等的发展为细胞色素P450酶的发现奠定了基础(杨建丽,2005)。 9

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 迄今,关于CYP450酶系的研究已有半个多世纪的历史(IsiIl ef口,.,2007)。 细胞色素P450基因几乎存在于所有生物体的基因组中,人们发现,来源于不同 物种,或同一物种的不同品系,甚至同一品系的不同组织,所含有的CYP450酶 在分子量、免疫特性、光谱吸收特征、调控机制、氨基酸序列以及底物专一性等 等方面都是不同的。细胞色素P450酶系具有的共同分子结构是,包含着一个非 共价结合的血红素以及邻近于该血红素区域的一段氨基酸保守序列,在这段保守 序列中处于完全保守状态的半胱氨酸是血红素铁的第5个配体,也是血红素铁在 接受一个电子被还原后,与CO结合在450nlIl处呈现出特征吸收峰的原因。细 胞色素P450酶的另外一个特征就是具有可诱导性,很多化学物质对CYP450酶 都具有诱导或抑制作用,且各自的作用机制都不相同。

细胞色素P450酶系是自然界中催化作用最具多样性的生物催化剂,是一类 具有多种功能的氧化酶系,在生物体内可被视为单加氧酶、酯酶或脱氢酶等等发 挥作用(虞青,2008)。CYP450酶的底物谱范围广,底物结构差别大,不同种 CYP450酶的底物谱存在交叉重叠现象(李红梅,2006)。具体来说包括许多外 源性物质如植物代谢次生性物质、抗体和有机合成化合物等等,和多种甾醇以及 ~些生理过程产生的脂类。人类制造的有机化合物大多是细胞色素P450酶可能 的底物,其中许多可作为CⅦ450同工酶的诱导剂或抑制剂。细胞色素P450蛋 白种类的多样性使其可以催化多种类型的反应。

1.3.2细胞色素P450BM.3的结构与性质

细胞色素P450BM-3(CYP450BM.3),可溶于水,最初分离自巨大芽孢杆菌 (B口c讲淞^北舶f酬“m)(高舜晔,2006)基因组中,能催化饱和/不饱和的脂肪 酸、脂肪酰胺和脂肪族醇(C12.C20)进行末端氧化,但不包括脂肪酸酯(李青山 等,2001)。

细胞色素P450BM.3属于双功能酶,包含着细胞色素P450102(ECl.14.14.1), 分子量为55l(Da;与NADPH:细胞色素P450还原酶(ECl.6.2.4),分子量为66kDa (虞青,2008)。其三级结构是由0【.螺旋和p一折叠片组成,且以a.螺旋为主(图 1.6)。蓝色部分表示血红素域,其中红色部分表示血红素,血红素域负责底物连 接和吸收氧原子,绿色部分表示黄素结合域,其中的黄色部分表示FMN,黄素

lO

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 结合域能接受从NADPH传递过来的电子并将其转移到血红素域活性部位。在被 胰蛋白酶水解后,血红素域仍具有底物结合活性,并能和CO作用呈现出450l珊 的特征吸收峰,与此同时,黄素区域仍保留有NADPH依赖的细胞色素还原酶活 性(1’akahashi Pf口,.,2007)。

图1.6细胞色素P450BM.3的三维结构(引自stemmer’1994)

Fi昏Ⅱ.e 1.6S仃1】cturc of tlle c”0cbrome P450BM.3with玎aVin domain(伊∞n),heme domain(blue), heme(red)and the FM:N(yellow)(厅om Stemmer,l 994)

下图是介绍细胞色素P450BM.3的催化机制。其中,血红素结构域负责底物连 接和分子氧的吸收;黄素结构域(FMN和FAD)负责从NADPH接受电子并将其 转移至血红素活性区域,细胞色素P450BM.3催化反应同样需要辅酶提供电子(李 红梅,2006)。首先,细胞色素P450BM.3与底物进行结合,NADPH被氧化为 NADP+,电子经由FAD/FMN,最后被转移至血红素区域,此时分子氧被还原分 解,底物lm被转化为ROH,同时伴随着H20的生成(图1.7)。

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论

NA NADPt

Hlnge

“. ,。 .。~。 RoH ,+

图1.7细胞色素P450BM.3催化机制(引自李红梅,2006)

Figure 1.7PictI】re of the catal”ic syStem of

cytochro眦P450BM.3(舶m“Hong-Mei,2006) 细胞色素P450BM-3具有可用于处理有机废物和工业污染物的潜力,而且可以 用于药物和其它化学物质的生物合成及转化(Puneet订口,.,2008)。尽管野生型的 细胞色素P450BM.3只对链长为C12-C20的饱和/不饱和脂肪酸及其类似物具有活 性,但随着研究的深入,许多具有独特功能的细胞色素P450BM-3突变体的出现, 将使其在医药、化工、环境和农业等各个领域内得到广泛的应用。

1.3.3细胞色素P450BM-3的定向进化研究

・O

目前,关于细胞色素P450BM-3的研究主要体现在探讨CYP450BM.3的结构特 征及其催化机制、开发廉价的电子传递系统和改造细胞色素P450BM.3三个方面。 细胞色素P450嘲.3在催化反应中需要由NAD(P)H作为其电子供体,但这极不经 济,严重阻碍其在工业生产中的应用(Maurer Pf口,.,2003)。而包括建立辅酶再 生系统、氧的电化学还原和过氧化氢支路等一些廉价的替代方案已被提出用于解

杭州师范大学硕士学位论文 1绪论 决这一问题。对CYP450BM.3进行改造的目的是使其获得新的催化功能,提高其 催化效率(Alexander Pf口,..2009)。

细胞色素P450BM.3是一个被广泛研究的sel£su硒cient P450蛋白,通过定向 进化途径不仅能够获得许多具有新功能的CⅦ450BM.3突变酶,而且还可以通这 些突变酶为其结构与功能关系的研究提供更多有价值的信息(Schwanebe唱甜口,., 1999;Li甜口,.,2001),目前,已经积累了许多有关细胞色素P450BM.3定点突变及 其相关活性的资料(Chen Pf口,.,2008;Jared田口,.,2009;Canl(ar日口,.,2011)(表 1.1)。

表1.1细胞色素P450BM.3定向进化举例(引自李红梅,2006)

Table 1.1Samples 0f c”0cllrome P450酬.3mutantS%gilleered by dhcted e、,olution(:丘.om Li H0n哥Mei,2006)

C”ocllrome P450BM.3舢tants 定向进化措施 功能性质的改变

A74G/F87V几88Q 饱和突变和理性设计 拓宽了对脂肪酸类似物的催 V26T门R47F/A74G/F87v/L188Q

~…R47F/A74G/F87V/Ll 88Q

化专一性

Y78Ⅷ138Y厂r175姒184V/H236Q/StEP和易错PCR 与野生型相比,羟化正己烷

E252G/R255S,A290V/A295S,1053V

A74G/F87V几188Q

V78A,A328F

V78F,A82S,A328F

F87A,R47UY51F

R47L/Y5l F/F87A

lⅥ7UY51F/A264G

R47L,Y5l F/M354A

R47U吖5l F/L437A

的活性提高了20倍,羟化辛 烷的活性提高了30倍

饱和突变和理性设计 获得对杂环化合物催化活性 饱和突变 提高了对乙醇的活性

定点突变 提高了对多环芳烃的氧化活 性

R47L,Y51F/F87A/A264G

13

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论 Ca册ichael等(2001)报道了利用定向进化技术发现的CYP450BM.3的两个 疏水性突变R47L和Y5lF,这两种突变导致CYP450BM.3对多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocafbons,PAHs)如菲、蕙和荧的催化活性提高了20多倍,进一步研 究发现,M354和L437等也属于细胞色素P450BM.3的活性位点。Li等(2001)对来 自巨大芽抱杆菌的CYP450BM-3一F87A进行“理性进化”,成功的提高了它对中等 链长的烷烃类似物(C8.Clo)的催化效率。France等利用定向进化技术得到了一系 列对有机溶剂具有更高耐受能力的CYP450BM.3突变酶,这些突变体对四氢呋喃 的耐受能力提高了10倍,对二甲亚矾的耐受能力提高了6倍;此后,他们又报 道了通过对CYP450BM-3进行饱和突变获得的一些突变体,这些突变体对短链烷 烃末端羟化的立体选择性从83%提高到了95%。

综上所述,定向进化不仅可提高细胞色素P450BM-3的催化效率,而且能使其 获得对非天然底物,如人工合成的有机化合物芳香烃、烷烃、有机氯和多氯联苯 等等的催化能力,显示出了此项技术在改造细胞色素P450BM-3功能方面的巨大潜 力。尽管如此,利用定向进化来对细胞色素P450BM.3的催化活性进行干预仍然面 临着诸多困难。当然,如何建立起高效的筛选和选择方法也非常重要。

1.4课题目标及主要研究内容

生物酶法催化生产圆柚酮的优点是对环境友好、反应条件温和。但目前报道 的利用细胞色素P450BM-3突变体催化瓦伦西亚烯生产圆柚酮的产率太低,并且副 产物过多。如果我们能对P450BM.3进行蛋白结构改造,使其催化生成圆柚酮的产 率和特异性进一步提高,则将会为最终实现圆柚酮的生物酶法工业生产打下良好 的基础。

本课题的研究目的是:利用基因工程技术,对野生型细胞色素P450BM-3基因 进行定点突变,以获得合适的突变体,能够高效、特异地催化瓦伦西亚烯生成圆 -O

柚酮(图1.8)。主要研究内容包括:

1)确定合适的目的基因表达系统在作者所在课题组的前期研究工作中, 已经通过PCR从巨大芽孢杆菌(肋ci盯船脚唧切诹坍,A:rCC 14581)的基因组中 克隆获得野生型细胞色素P4508M.3基因,再TA克隆连接到pMDl9.T载体上,并通 过PCR定点突变技术获得了突变体R47UY51F,F87A。本文拟采用PCR技术,向

14

杭州师范大学硕士学位论文 l绪论

细胞色素P450BM.3和R47LⅣ51F/F87A基因两端分别引入人kD I和&DR I限制性内 切酶序列,并在终止密码子前插入6个组氨酸密码子,以便能通过双酶切途径将 目的基因连接入pET28a(+)表达载体,构建成重组表达质粒后转化大肠杆菌BL2l (DE3),以检测此表达系统是否有效。

2)探索最佳的诱导表达条件 目的基因的表达一般采用IPTG进行诱导, 但最终的IPTG使用浓度、细菌培养温度和诱导表达时间等等都需要进一步的探 索,以便能确定本实验中最佳的蛋白诱导表达条件。

3)目的蛋白纯化方法的研究 固相金属亲和层析(IMAC)是实验室常用的 蛋白纯化方法之一,根据已有的文献研究报道,我们拟在目的基因3’端加上 His.Tag融合标签,目的蛋白经诱导表达后,进行金属鏊和层析试验,并通过 SDS.P入GE检测纯化效果。

4)酶催化产物的检测方法液相色谱和气相色谱都被报道曾用于圆柚酮相 关研究的分析(Rebecca甜a,.,2005),其中气相色谱检测的优点是灵敏度高、 分析速度快、所需试样少和操作简单等等,因而是本研究重点试验的方法,包括 确定最佳的气相色谱分析条件。

5)新突变体的设计这是本研究的创新所在。细胞色素P450BM-3是一个被 广泛研究的selfsumcient P450蛋白,目前已经积累了许多突变和相关活性的资 料(Grazyna Pf口Z.,1997),涉及了很多该酶活性区域的氨基酸。相对于饱和突变 的随机性,对已有细胞色素P450BM.3氨基酸突变的资料进行分析、总结,是本研 究中蛋白定点突变设计的重要依据。

9

P450B^d.3

mutar止s

O

(+)・V ale纰ene (+).NooIk札∞。

图1.8CYP450BM.3突变体催化瓦伦西亚烯生产成圆柚酮

Fig.1.8BiotransfonTlation of(+)-Valencene to(+)一nootkatone by CYP450BM.3nmtants

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建 2重组表达质粒的构建

2.1引言

利用蛋白表达系统来表达目的基因,是研究基因的功能及相互问作用的重要 手段。根据不同的实验要求,如表达量的多少、目的蛋白的活性和纯化方法,可 选择不同的表达系统及合适的诱导表达途径。目前,重组蛋白表达系统主要包括 哺乳动物及昆虫细胞表达系统、酵母蛋白表达系统和原核蛋白表达系统。其中, 原核蛋白表达以大肠杆菌表达系统最为常见,具有成本低、表达量高、遗传背景 清楚和表达产物分离纯化相对简单等等优点,一直是实验室最常用的表达系统之 一。pET28a(+)是实验室常用的原核表达载体之一,利用PCR克隆获得所需的野 生型及各种突变体基因,再双酶切后连接入pET28a(+)中,构建成重组表达质粒 (图2.1,图2.2)。

16 . 图2.1重组表达质粒构建策略

Figu他2.1The cons仇lni仰sn翟teg)r ofr∞onlbi衄nt plas嘶d

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建

2.2材料与方法 2.2.1菌种与质粒

一_

3.53

惑勰I+)

《5369bp)’ ’

、\/Sph 115∞)

‘、、

、●

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~一/夕礴溉 图2.2pE亿8a(-崎表达载体

Fig 2.2pET28a(+)Vector

・O

E.cD『f DH50【、E cDff BL21(DE3)由本实验室保藏。

表达载体pET28a(+)由本实验室保藏,克隆载体pMDl9.T购自宝生物工程(大 连)有限公司。另外,克隆质粒pMDl9-CYP450BM.3和pMDl9.R47LⅣ5lF/F87A 已由本实验室构建。

2.2.2试剂与器材

本章实验所用主要试剂见表2.1,除特别说明外,所用化学试剂均为分析纯。

表2.1实验中主要试剂

Table 2.1Main reagents f.or the e)【p撕ment

-———_—————-——_-———————————————_———————-——————_-—-_————一

试剂名称 生产厂商

-●————————l●——_——————-—_-———————__————————-————_-—___———一 砂m6鲫f DNA Polyn研a∞,l 0x毋m6船f Bu仃打U,dNllP

Mi)【mrc 6×LQading Bufnx,DL5000DNA Mark盯,DLl 5

000DNAMarker

AgaroSe Gel DNA

P谢fication硒t

l O×A—Tailing Bu眠A-Ta订ing E北yme

pMDl 9-T Si唧le Vector

T4DINA“ga∞,10×Ligati∞bufl.盯

E.Z.N.A.plasmidmillil【it I(100)

超级感受态细菌制备试剂盒

且,cD I&上’cDR l restricti∞e舷yme,Buf】衙10×Tango NaCl

Agamse

1fb,pt册e,Yeast Ex仃act 宝生物工程(大连)有限公司 On把ga Bio-tek

I眦.

碧云天生物技术研究所 上海试四赫维化工有限公司 Biow髓t

Oxoid

Kanamycin,Ampicillill’琼脂粉 鼎国昌盛生物技术有限公司 18

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建 所用主要器材见表2.2。

表2.2实验中主要器材

’rable 2.2Main equipments fbr the experiment

2.2.3实验方法

PCR克隆获得野生型CYP450BM.3和R47L/Y51ⅣF87A基因

以野生型CYP450BM.3(GenBaIll(accession No.:J04832)核苷酸序列为模板,设 计PCR引物,在目的基因两端分别引入ⅣcD I和&DR I酶切位点,并在终止密码 子前插入6个组氨酸密码子。

Forward:5’一CArGg£叁苫QQCAATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCC-3’ (划横线处表示ⅣcD I酶切识别序列)

Reverse:5’.G鱼△丛I£TTA(ATG)6CCCAGCCCACACGTC一3’(戈0横线处表 示&DR I酶切识别序列)

PCR反应体系:向0.5ml灭菌的Eppendor借中加入下列试剂,并混匀。 19

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建

三三i 圣 三{三 ]}-3。 c y c -e s 66℃ 45s 卜30cycles

72℃ 3miIl一,

电泳及切胶回收

PCR结束后,将全部产物分别加6×L0adiIlg Bu腩谜行混匀,点入琼脂糖凝 胶中在90v下进行电泳。1%琼脂糖凝胶的制作:称取0.2g琼脂糖加入到20lnl l×TAE Bu仃er中,加热使琼脂糖溶解。

待电泳结束后,将凝胶移置紫外灯下,观察并切下目的基因条带,此过程要 尽可能快,以防止DNA长时间在紫外照射下受损。用Agarose Gel DNA Pu—ficatjon刈t回收目的基因片段,具体操作步骤如下:

1)将含有目的基因的胶带切碎、称重,并转化为体积数据(1mg胶体积约 为l山);

2)加入3倍体积DR.I Bu行er,于75℃水浴中10miIl,间断振荡使凝胶融 化;

3)加入DR.II Bu腩r(DR-I

Bu腑体积的一半),混匀;

4)将溶液转移至收集管中,12000印m离心l miIl,弃滤液:

5)加入500ul Rinse A,12ooO rpm离心1min,弃滤液:

6)加入500“l Rmse B(首次使用前,按说明书要求加入56ml乙醇),12000 rpm离心1池,弃滤液;

7)将收集管放入1.5m1Eppendorf管中,加25pl无菌水(事先温浴至60℃) 静置1miIl,12000印m离心l rnjn,洗脱DNA,可直接用于后续实验或 .20℃各存。

在平滑DNA片段3’末端添“A”及TA克隆

1)在1.5IIll Eppendorf管中配制下列添“A”反应液:

10×A.Tailing

Bu骶r 5pl

A-TailiIlg Enzymc O.5pl

刚TP Mi)【nlre 4山

切胶回收后的DNA片段 全部加入

ddH20

丰}足至50pl;

2)混匀后于72℃水浴中反应20miIl;

3)冰中静置1~2min;

4)用p加19.T Simple Vector试剂盒进行TA克隆,向0.5111l灭菌的Eppendorf 管中加入下列试剂,并混匀:

pMDl9一T Vector l pl

步骤3)的A-Tailillg DNA溶液 O.1 ̄o.3pmol

ddH20

卒}、足至5pl;

5)加入5“l的Solution I;

6)16℃反应30曲。

LB培养基的配制

Tryptone

Yeast Extract

NaCl

加100ml纯水混匀,

1g

0.5g

1g

若为固体培养基则需另加入1.5g琼脂粉,高温灭菌。 2l

大肠杆菌感受态细胞的制备

使用超级感受态细菌制备试剂盒来制备实验所需的大肠杆菌感受态细胞:

1)从-80℃冰箱中取出甘油保存菌种,冰上放置;

2)在超净工作台环境中,用无菌铂丝蘸取大肠杆菌菌液,在已经高温高 压灭菌的LB固体培养基上划线,先正放30mjn,再于37℃中倒置 培养过夜:

3)挑取单菌落,于2lnl LB培养液中37℃180巾m培养过夜,注意无 菌操作;

4)取100¨l过夜菌液加入到超级感受态细菌培养液中,于37℃下180巾m培养;

5)当∞600达到0.6 ̄O.7时,将培养的菌液置于冰浴中,冷却15mill;

6)4000g离心5lllin收集菌体,弃上清,离心机必须预先冷却至4℃;

7)用20111l预冷的超级感受态制备试剂A轻轻重悬细菌沉淀,冰浴15 miIl:

8)4000g离心5IIlin收集菌体,弃上清,离心机必须预先冷却至4℃;

9)用2ml预冷的超级感受态制备试剂B轻轻重悬细菌沉淀,冰浴15 miIl:

10)在冰上分装成100pl每Eppendorf管,可直接用于转化,也可于-80℃冻存。

大肠杆菌的转化

1)取一管大肠杆菌感受态细胞(冻存的感受态细胞于冰上融化),将质粒溶 液或DNA连接产物轻轻加入感受态细胞悬液中,冰上放置30IlliIl;

2)42℃水浴热击90s,再冰上冷却l~2nliIl;

3)加入900¨l LB培养液,于37℃下180印m培养l h;

4)取100山菌液涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上,37℃先正放30 miIl,再倒置培养过夜。

质粒提取

挑取新鲜培养的单菌落于3ml含相应抗性的LB(Lubria.Benani)培养液中, 37℃下180叩m培养过夜。采用Omega生物技术公司的E.Z.N.A.plasmid miIli kit I(100)来提取质粒:

1)取1.5ml菌液至Eppendorf管中,100009离心l min收集菌体;

2)加入250¨l Solution I(事先按说明书要求加入RNase A)重悬菌体;

3)加入250pl Solution II,缓慢颠倒混匀,静置2min;

4)加入350pl Solution III,并立即混匀,室温100009离心lO mill;

5)小心吸取上清至2ml收集管的Hm洒d MiIli pr印柱中,室温100009离心 l mm:

6)弃滤液,加500pl Bu脑髓,室温100009离心l IIliIl:

7)弃滤液,加700“l DNA wash Bu脓(事先按说明书要求加入80llll乙醇), 室温下10ooOg离心l I血,弃滤液,再重复操作一遍;

8)室温130009离心2min,弃滤液;

9)将HiBilld M访i pr印柱放入新的1.5ml Eppendorf管中,于柱膜中央加入 50pl纯水,室温静置l mill,130009室温离心l min,将所得质粒溶液 于.20℃保存。

质粒双酶切

在灭菌的O.5ml Eppendorf管中加入下列试剂并混匀:

Bu骶r10׉go 2¨l

ⅣcD I O.5“l

EcDR 10.5“l

plasmid 5“1

ddH20补足至10山

于37℃水浴反应1~16h,双酶切使用的缓冲液由两种限制性内切酶的性质 来决定。

目的基因与载体的连接

在灭菌的O.5lIll Eppendorf管中加入下列试剂并混匀:

T4DNALigase l pl

10×Ligation bufrer 1pl

Vector的gment 3“l

i11sert DNA丘agment 3pl

于16℃反应过夜。

2.3结果与分析

2.3.1目的基因两端添加酶切序列

基因CYP450BM-3和其突变体R47L腭5l阶87A的PCR电泳见图2.3,且已分别 在基因的5’和3’末端添加了^均I和&侈R I限制性酶切序列、(His)6融合标签, PCR所用的酶为毋加6嚣f DNA Polymerase,以避免PCR过程中发生碱基突变。电 泳纯化后(图2.4),在DNA片段两端添加“A"尾,以便进行下一步TA克隆。基 因CYP450BM.3长约3.1kb。

图2.3目的基因PCR电泳结果

M:Marker(单位为bp);L粕e l:C佃450BM.3基因;【加e 2:CYP450BM.3-R47L,Y5lF/F87A 基因

Figu心2.3Gcl elec廿ophor瞄is of tlle target gen骼

M:Mark呱皿it bp);Lane 1:CYP450叫-3g%e;La鹏2:CYP450B啪・R47UY5lF佰87A g锄 24

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建

图2.4目的基因的切胶回收产物

M:M砌泔(单位为bp);La∞l:CYP450喇.3基因;Lane 2:CYP450BM.3.1M7L,Y5lF/F87A 基因

FigⅢe 2.4The target g∞es ex仃action厅om ag盯0se gel

M:Marker(uIlit bp);La北l:CⅦ450酬.3gene;Lane 2:a伸450BM.3-IH7L.,Y51F/F87A gene

2.3.2目的基因连接入pMDl9-T载体

将A.Tailing DNA溶液直接用于TA克隆,16℃反应后的溶液再转化感受态大 肠杆菌DH50L,涂布含Anlp+的LB固体培养基并于37℃倒置培养过夜。分别从含 有野生型目的基因和突变体R47L,/Y5lF/F87A的两个筛选平板上挑取3个单茵落 进行PCR鉴定(图2.5),PCR的引物:Forward:5’.CATGCCATGGCAATGACAATT AAAGAAATGCCTCAGCC・3’;ReVerse:5,-GGAATTCTTA(ATG)6CCCAG CCCA CACGTC.3’,PCR程序参考2.2.3。

25

杭州师范大学硕士学位论文 2重组表达质粒的构建

图2.5菌液PCR鉴定

M:Mark盯(单位为bp);Lane 1.3:单菌落挑自含野生型目的基因的抗性平板;hne 4.6:单菌落挑自含突变体R47L,Y5lF/F87A的抗性平板

Figure 2.5

ld蛐ti6cation ofthe bact嘶al哪pe璐ion by PCR

M:Ma成叫unit bp);La矾l・3:Sin百e c01∞y containjng the诵ld-咖e g%e;L舳e 4-6:Single col∞y c∞taining也e R47LⅣ5

l阶87A g眦

图2.5中,2、4、5号泳道出现了单一且明亮的条带,表明各自的菌落PCR 产生了可能的目的基因片段,而l、3、6号没有,推测可能由于载体自连,转化 进宿主菌中的质粒并没有被嵌入目的基因。

从中挑取2、5号单菌落分别加入到含Amp+的LB培养液中,置于空气恒温 摇床37℃下180印m培养过夜,提取质粒后PCR进一步鉴定(图2.6)。

图2.6质粒PCR鉴定图

M:Marker(单位为bp);Lane 2&5:分别表示图2.5中的第2、5号单菌落质粒PCR 的结果

Figure 2.6Identification ofplasn矗d PCR

M:Mark盯(unit bp);La地2&5:PlasIIlid PCK which丘-0m thc 2nd and 5th sin酉e colony in Figure 2.5respe娟vcly

菌落、质粒PCR均在3.1kb附近产生了单一、明亮的条带,将2、5号菌液 送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序,用C10neManager对测序结果和 野生型CYP450BM-3基因序列(GenBanlc accession No.:J04832)进行比对,表明野生 型CYP450BM.3和突变体R47L/Y5l F/F87A基因两端分别已被成功添加了^,cD I 和E∞R I限制性酶切序列,在基因终止密码子前添加了(His)6融合序列标签,其 它位置没有发生碱基突变。

2.3.3pET28a—CYP450BM.3重组表达质粒的构建

对pET28a(+)载体和pMDl9-CYP450BM.3重组克隆质粒分别进行双酶切,电 泳回收后,再进行目的基因与载体的连接反应,一般将10“l连接后体系直接转 化感受态大肠杆菌BL2l,并用含Kan+LB抗性平板来筛选阳性克隆,采用质粒 双酶切法对阳性克隆单菌落进行鉴定(图2.7)。

321M

图2.7pElr28a(+).P450BM-3重组表达质粒的双酶切鉴定

M:Mark盯(单位为bp);Lane

1&2:重组质粒pE他8a(廿P45‰。的ⅣcD I值cDR I双 酶切结果;h∞3:重组质粒pE他8a(+).P450BⅢ

Fig叮e 2.7Double dig豁tion of

reconlbin彻t plaslllid pE他8a(廿P450BM.3

M:Marker(1mit bp);La鹏l&2:Ⅳco

I胁DR 1double digestj伽ofrccombin柚t pl鹤111id pElr28a(+)・P450BM.3;hm 3:r∞onlbinant plaslIlid pElr28a(+)一P450删-3

如上图所示,在5000bp上下,各有一条单一条带,其中,CYP450BM-3基 因片段长约为3.1kb,pET28a(+)载体片段长约5.3kb,表明目的基因与表达载体 连接成功。

2.3.4pET28a-R47坍5lF/F87A重组表达质粒的构建

pET28a-IH7I/Y5l F/F87A的构建过程与pET28a-CYP450BM.3相同(图2.8), 利用PCR向突变体R47W5l阶87A基因两端分别添加ⅣcD I和艮DR I酶切识 别序列后,通过双酶切将其连接入pET28a(+)表达载体中,构成重组表达质粒。

。

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